Pesticider og elektromagnetiske felter – en dårlig kombi for vores bier
Illustration: Satellitbillede af de eksperimentelle steder, fra Stuidet.
Der har længe været en stigende bekymring for reduktionen i antallet af bier samt bestøvere i det hele taget.
Men hvad er årsagen til at bierne forsvinder? Hvilke ændringer i miljøet kan begrunde nedgangen?
Mange hævder, at det er pesticidernes skyld. Og påpeger man den den trådløse radiofrekvente stråling som en mulig faktor, er man i stor risiko for at blive kaldt en sølvpapirshat.
Men et studie fra Italien, Daniela Lupi et al. (2021), viser, at godt nok er pesticider ikke godt for bierne, men kombineres pesticider med elektromagnetiske felter bliver situationen endnu værre.
I dette studie viste den kumulative effekt af kemisk og elektromagnetisk felteksponering (multistress-tilstande) den værste generelle helbredstilstand, taget hensyn til koloniens overlevelse, patologisk fremkomst og adfærdsmæssige anomalier som unormal honninglagring og overskud af drone-yngleaflejring.
Et kort resume af studiet
Multistress-tilstande anses for at være den mest formodede årsag til honningbiernes tilbagegang. Den fortsatte reduktion af tamme og naturlige bestøvere betragtes som et meget alvorligt signal om det nuværende tab af biodiversitet, og det kræver en bred forskningsindsats for at klarlægge årsagerne. I dette studie blev de kombinerede effekter af to mulige stresskilder for bier, pesticider og elektromagnetiske felter (multi-stressforhold), analyseret ved et feltforsøg.
Efter et års overvågning var der et komplekst billede af flere inducerede effekter, især i multistress-området, såsom sygdomsforekomst (amerikansk foulbrood – en meget smitsom, dødelig bakteriel sygdom hos honningbi-larver), højere dødelighed i underkurvene – de nederste strukturelle rum i bistader (almindeligt for pesticid-stressstedet), adfærdsændringer (dronningeændringer, overskud af både drone-rug-aflejring og honninglagring) og biokemiske anomalier (højere ALP-aktivitet (fordøjelsesenzym) ved sæsonens afslutning). Multistressstedet viste den værste sundhedstilstand af bikolonierne, med kun én i live ved afslutningen af eksperimentet ud af de fire, der var til stede i begyndelsen.
Studiet
Kombinerede effekter af pesticider og elektromagnetiske felter på honningbier: Multi-stress eksponering
Daniela Lupi, Marco Palamara, Agnese Adani, Roberto Benocci, Roberto Giacchini, Paolo Parenti, Giovanni Zambon, Antonio Lavazza, Maria Beatrice Boniotti, Stefano Bassi, Mario Colombo, Paolo Tremolada: Combined Effects of Pesticides and Electromagnetic-Fields on Honeybees: Multi-Stress Exposure. Published by MDPI, August 2021. https://doi.org/10.3390/insects12080716
Understregninger er her tilføjet.
Abstrakt
Tilbagegang af honningbier og generelle bestøvere rapporteres i vid udstrækning i mange lande, hvilket tilføjer ny bekymring til det generelle tab af biodiversitet. Mange studier blev undersøgt for at vurdere årsagerne til tilbagegangen i bestøverbestanden, og konkluderede, at multistress-effekter i de fleste tilfælde var de mest sandsynlige. I dette studie blev de kombinerede effekter af to mulige stresskilder for bier, pesticider og elektromagnetiske felter (multistress-forhold), analyseret i felten. Tre forsøgssteder blev valgt: Et kontrolsted langt fra direkte menneskeskabte stresskilder, et pesticid-stress-sted og et multistress-sted, hvor den samme eksponering for pesticider blev tilføjet tilstedeværelsen af et elektromagnetisk felt, der kommer fra en højspændingsledning. De eksperimentelle bigårdeblev overvåget ugentligt i et år (fra april 2017 til april 2018) ved hjælp af koloniens overlevelse, dronningens aktivitet, opbevaring og yngelmængde, parasitter og patogener samt flere biomarkører i unge arbejdere og pupper. Både eksponerings- og effektbiomarkører blev analyseret: Blandt de første, acetylcholinesterase (AChE), katalase (CAT), glutathion S-transferase (GST) og alkalisk fosfatase (ALP) samt reaktive iltarter (ROS); og blandt sidstnævnte, DNA-fragmentering (DNAFRAGM) og lipidperoxidation (LPO). Resultaterne viste, at biernes helbredstilstand var værst i multistress-området med kun én koloni i live ud af de fire til stede i starten. På dette sted blev et komplekst billede af bivirkninger observeret, såsom sygdomsopståen (amerikansk foulbrood), højere dødelighed i underkurvene (almindeligt på pesticid-stresssteder), adfærdsændringer (dronningeændringer, overskud af honninglagring) og biokemiske anomalier (højere ALP-aktivitet ved sæsonens afslutning). De samlede resultater viser tydeligt, at de multistressede forhold var i stand til at fremkalde biokemiske, fysiologiske og adfærdsmæssige ændringer, som alvorligt truede bikoloniernes overlevelse.
Uddrag
1. Introduktion
Kuben er et komplekst system, der reguleres af mange biologiske, kemiske og ernæringsmæssige faktorer; Alle individerne bidrager til familiens vedligeholdelse gennem en højt koordineret aktivitet. Ligevægten er dagligt i fare, når arbejderne patruljerer et miljø, der er stærkt modificeret og fyldt med menneskeskabte forurenende stoffer, især i mere udviklede lande. Derfor er dårlig ernæring og sult [1,2,3], sygdomme [4,5], mider [6,7], tab af levesteder og fragmentering [1,8], forurening med pesticider og andre forurenende stoffer [9], elektromagnetiske felter [10,11,12] og generelle miljømæssige belastninger, herunder klimaforandringer [6,13] blevet angivet som mulige årsager til biernes generelle tilbagegang og til fænomenet kaldet colony collapse disorder (CCD) [14,15,16,17,18].
I øjeblikket anerkendes multi-etiologiske faktorer som den mest sandsynlige årsag til, at CCD forekommer i forskellige dele af verden [19,20,21,22,23].. Stressede bier er mere tilbøjelige til at udvikle sygdom og kan modstå mindre ydre tryk, hvilket skaber en kaskadeeffekt [24,25,26]. Når honningbier udsættes samtidig for flere kemikalier, kan de som følge heraf udvise synergistiske, additive eller antagonistiske effekter [11,27,28]; Pesticider kan spille en grundlæggende rolle i at kompromittere koloniens sundhed og øge koloniens modtagelighed for skadedyr og patogener [7,29,30]. Submortale og langsigtede effekter kan virke sammen og give uforudsigelige konsekvenser, da kronisk eksponering for negative stressfaktorer gradvist svækker kolonierne, mindsker deres ydeevne, gradvist reducerer dronningens frugtbarhed og ændrer arbejdernes evne til at lære og fouragere [31,32,33]
Selvom mange studier rapporterer effekten af en enkelt stressfaktor [34,35,36,37], er der færre og nyere studier, der evaluerer rollen af multifaktorinteraktion på honningbier [38,39,40,41]. Studier af kombinerede stressfaktorer i laboratoriet gør det muligt at tilføje information om direkte effekter på bier, men nærmer sig langt fra den virkelige verdens kompleksitet. Derfor er feltstudier essentielle for at forstå kombinerede stresseffekter på honningbier, selvom deres kompleksitet i forhold til miljømæssige variable og forstyrrende faktorer ofte gør fortolkningen af resultaterne vanskelig. Et tidligere arbejde [11] undersøgte effekterne af pesticider og elektromagnetiske felter, men separat i forskellige forsøgssteder (enkeltstressforhold). Dette studie viste, at elektromagnetisk stress inducerede en bred enzymatisk overaktivering ved sæsonens afslutning. Ifølge andre videnskabelige fund [42,43] var den enzymatiske overaktivering relateret til en adfærdsmæssig overaktivering i en periode, hvor bierne burde forberede sig på overvintring, hvilket kan udgøre et problem for vinteroverlevelsen [11].
Det foreliggende studie foreslår en multi-stress tilgang til at studere den kombinerede effekt af pesticider og elektromagnetiske felter med et eksperimentelt forsøg i felten. Eksperimentelle bigårde blev udsat for pesticidstress og multistressforhold (pesticider og elektromagnetisk felt). Den elektromagnetiske feltkilde blev bestemt af en højspændingstransmissionsledning, der gik lige over det multistressede område, mens eksponering for pesticider var almindeligt på multistress-områder, fordi begge var placeret i en frugtplantage, hvor mange kemiske behandlinger med insekticider og fungicider blev udført næsten kontinuerligt fra marts til oktober. De to stresssteder, cirka 300 m væk, lå tæt nok på til at blive udsat for samme eksponering for pesticider ved indsamling, men tilstrækkeligt fjerne til at være forskelligt udsat for de elektromagnetiske felter forårsaget af højspændingsledningen. De eksperimentelle bistader i eksponeringsstederne blev sammenlignet med dem i en kontrolbistade placeret 15 km væk i en naturlig vegetationskontekst. Kontrol- og eksponeringsbistader blev tjekket ugentligt for populationsparametre og koloniernes sundhedsstatus. En række biomarkører blev brugt til at detektere biokemiske variationer og cellulære stressparametre. Blandt de første blev kvantificeringen af reaktive iltarter (ROS) og fire forskellige enzymatiske aktiviteter testet med hensyn til neurotransmissionsfunktion (acetylcholinesterase, AChE), antioxidationsrespons (katalase, CAT), afgiftningsveje (glutathion S-transferase, GST) og metabolisk effektivitet (alkalisk fosfatase, ALP). Blandt cellulære stressparametre blev skader på genetisk niveau analyseret ved kvantificering af DNA-fragmentering (DNAFRAGM) og skader på membranens funktionalitet ved kvantificering af lipidperoxidationsniveauet (LPO).
Specifikke mål med denne forskning omfatter: (i) biomarkøranalyse som et tidligt varslingsværktøj til identifikation af stressfaktorer; (ii) analyse af stress induceret af eksponering for pesticider; (iii) evaluering af effekterne forårsaget af multistress-forhold (pesticider og elektromagnetisk felt).
4. Diskussion
Bestøvernes grundlæggende rolle for landbrug og biodiversitet kræver evaluering af stresskilder for honningbier, især under markforhold. Et nyligt review [58] fremhævede, at de fleste studier af subletale effekter på bestøvere blev udført i Europa og Nordamerika, og de fleste studier var rettet mod insekticider og blev udført i laboratoriet under kontrollerede forhold. Vigtigheden af at teste reelle feltforhold er velkendt for at vurdere kompleksiteten af miljøfaktorer og mulige stresskilder. Selvom denne tilgang stærkt anbefales for økologisk realisme, byder den på flere problemer i definitionen af referencebetingelserne (kontrol), i fortolkningen af resultaterne (direkte årsag-virkning-identifikation) og i muligheden for ukontrollerede hændelser. Tabet af én bikube i kontrolstedet resulterede i en ret høj dødelighed på grund af det lave antal replikater (1 ud af 4, 25%), men vi vurderer, at dette sammenbrud ikke skyldtes stedets karakteristika (kontrol), men en ekstern begivenhed forårsaget af en ny dronning (erklæret parret, men desværre jomfruelig), der kom fra området efter tabet af den eksisterende dronning under parringsflyvningen. Den tidligere dronning, muligvis udskiftet på grund af stedets effekt, blev derfor taget i betragtning, da dronningeskift mellem behandlinger blev evalueret. Som en generel observation er det lave antal bistader på hvert forsøgssted (n = 4) en objektiv begrænsning, især fra et statistisk synspunkt, men studiets kompleksitet og det høje antal parametre, der blev analyseret på hver kube, pålagde dette restriktive valg. Dog er informationen fra den nuværende forskning kompleks, og på trods af det lave antal kolonier kan den give et billede af mulige reaktioner fra kolonier, der udsættes for effekterne af forskellige belastninger i felten.
På kontrolstedet blev der i én koloni påvist høje niveauer af DWV samtidig med et højt niveau af Varroa-angreb. Sammenhængen mellem varroa-tal og virusoverførsel er dokumenteret i litteraturen (f.eks. [65]). Det skete kun i én bistade, mens de andre var i god form under hele forsøget: Lav Varroa-infestation, lav virusregistrering, lav dødelighed i underkurvene, lave dronningeændringer og anomalier, udbalanceret opbevaringsakkumulering og rugeaflejring. På dette sted blev der, i modsætning til eksponeringsområderne (kemiske og multistress), ikke påvist nogen amerikansk foulbrood-sygdom, selv ikke i bistadet, der var stærkt påvirket af varroamider og DWV (CTl-2). Tværtimod blev der i juni 2017 opdaget ét tilfælde af amerikansk foulbrood i muli-stress-stedet og senere to andre tilfælde i det kemiske stress-tilfælde. Analysen af P.-larvesporer i bistade-affald indsamlet fra begyndelsen af forsøget viste, at P.-larvesporer voksede op i de bistader, hvor sygdommen opstod, men de var også til stede i lave niveauer i andre eksponeringsbistader og endda i et bistade på kontrolstedet (CTL-1). Oprindelsen af bistaderne var homogen (samme producent), og det var derfor ikke overraskende, at patogensporerne kunne have været til stede i alle bistader uafhængigt af behandlingen. Derfor antager vi, at lav forurening var til stede i begyndelsen af forsøget i alle kolonierne, og at tilstedeværelsen af stressfaktorer på eksponeringsstederne sandsynligvis begunstigede udviklingen af infektionen, hvilket øgede antallet af sporer og gav anledning til sygdommen. Denne hypotese understøttes af resultaterne opnået af [66] i en laboratorietest. I dette arbejde blev den kombinerede effekt af pesticider og P. larve-infektion på larvedødelighed undersøgt, og en synergistisk interaktion mellem en P. larva-genotype ERIC II og forskellige pesticidklasser i sameksponerede larver blev demonstreret. Enten organofosfat-dimethoatet eller neonicotinoiden clothianidin, der blev givet i submortale doser til larver, der tidligere var inficeret med AFB, forhøjede larvedødeligheden markant. Det er interessant, at P.-larvesporer ikke voksede op i kontrolstedet, selvom de formodes at være til stede, og symptomerne opstod ikke. Tværtimod opstod sygdommen på begge eksponeringssteder (kemisk og multistress), samtidig med påvisning af et højt antal sporer i bistadets affald. I litteraturen er den skadelige effekt af pesticider på biernes immunsystem velkendt [41]. Udover forekomsten af amerikansk foulbrood i pesticid- og multistress-områderne indikerede alle andre sundhedsstatusparametre, at eksponeringsstederne var udsat for betydelige stresskilder: Dødelighed i underkurven, især i maj og juni, viste højere niveauer af dødelighed blandt arbejderbier og dronninger; En højere frekvens af dronningeskift blev påvist i multi-stressstedet sammen med en større mængde honninglagring og en lavere mængde yngleaflejring. Faldne varroamider var høje i et af kontrolstedets kube (CTL-2), som nævnt ovenfor, men de var også særligt høje om efteråret i multistress-området. Den endelige overlevelse af blot én koloni i multi-stress-området var den slående kendsgerning af anomalierne og de problemer, der opstod i bikolonierne på dette sted.
Brugen af en række biomarkører på to livsstadier (pupper og arbejderbier) gjorde det muligt at studere disse parametre under “stressforhold” (eksponeringssteder), men også under “fysiologiske forhold” (kontrolsted). I litteraturen blev biomarkører allerede brugt til at teste forskellige belastninger (byforurening og pesticider) på Apis mellifera både i marken [67,68,69,70,71,72] og i laboratoriet [73,74,75]. I felten vælges en referencestation altid i afstand fra menneskeskabte kilder, men tæt nok på de eksperimentelle steder til at kunne sammenlignes direkte [68,69,70,74]. Al litteratur understreger behovet for at tage hensyn til både den sæsonmæssige [11,68,76,77,78] og den fysiologiske variation af biomarkører i forhold til livsstadie, alder og køn [79,80,81,82]. For eksempel er enzymer, der er involveret i metabolismen af mange xenobiotika, såsom cytochrom P450-komplekset i pupperne, endnu ikke lige så udviklede eller effektive som hos den voksne bi [83]; af denne grund understreger [84] behovet for at studere toksiciteten af pesticider (akutte og kroniske) i de præimaginale stadier i stedet for de voksne, som det faktisk kræves af europæisk lovgivning [85].
I dette arbejde blev puper og voksne bier i kontrolstedets biomarkørresultater signifikant påvirket af livsstadiet og prøvetagningsdatoen. Biomarkørværdierne opnået i pupperne var altid lavere end dem, der blev målt hos arbejderbier; kun den enzymatiske aktivitet af GST var højere i puppestadiet end hos de voksne bier, ifølge hvad der observeres hos andre arter [86]. En større ekspression af nogle klasser af gener, der koder for isoformer af GST-enzymet i larver og puppestadiet hos insekter og leddyr, blev rapporteret i litteraturen [11,87,88]. Lupi et al. [11] diskuterede sammenhængen mellem temperatur (sæsonvariation) og enzymatisk aktivitet hos bistadearbejder- og samlerbier og konkluderede, at biomarkørniveauerne sandsynligvis er mere relateret til den fysiologiske cyklus af bistadets aktiviteter (høj om foråret og sommeren og lav om efteråret) end direkte til den årlige temperaturcyklus. Om foråret og sommeren er bistadeaktiviteten ved både føderekruttering og yngelopdræt særligt høj, hvorimod om efteråret sænker bikolonierne deres aktiviteter, fordi de forbereder sig på overvintring. De nuværende resultater synes at stemme overens med Lupi et al.’s hypotese, i det mindste for nogle biomarkører. For eksempel viste AChE-aktiviteten en faldende tendens fra april til november, med maksimum i juni, hvor bikubeaktiviteten er på sit maksimum. Tværtimod synes CAT-aktivitet at være mere relateret til den årlige temperaturcyklus end til bistadeaktiviteten, både hos pupper og arbejderbier. Hos ektoterme dyr har temperaturer en direkte effekt på stofskiftet, og det er kendt, at en stigning i stofskiftet fører til en stigning i ROS-produktionen [89] og dermed til aktivering af antioxidantenzymer for at kompensere for overskuddet af ROS. Når antioxidantforsvaret ikke er tilstrækkeligt, kan oxidative skader opstå, såsom dem på membranlipider og proteiner. I dette arbejde synes LPO-niveauerne at være højere om sommeren end om foråret og efteråret, men det skete kun hos arbejderbier og ikke i pupper. Formodentlig var aktiveringen af CAT-aktivitet om sommeren, bestemt af ROS-overproduktion i denne periode, tilstrækkelig til at neutralisere oxidativt stress i pupper, men ikke i arbejderbier. Det er tydeligt, at de forskellige stadier (pupper og arbejderbier) reagerer forskelligt på de forskellige forhold under sæsoncyklussen; Derfor synes biomarkøraktiviteter ifølge [73,77] at være relateret til en kombination af klimatiske egenskaber, bikubeaktiviteter og fysiologiske karakteristika for de forskellige livsstadier.
Eksponering for pesticider i Europa vurderes først ved hjælp af hazard quotient (HQ) eller Toxicity Exposure Ratio (TER)-konceptet, som foreslås i EFSA’s vejledningsdokument om risikovurdering af plantebeskyttelsesmidler på bier (Apis mellifera, Bombus spp. og solitære bier) [90,91]. I analogi med hazard quotient (HQ), som er forholdet mellem mængden af aktivt stof tilført i kg a.i. hektar−1 og toksiciteten på bier i μg bi−1 (kontakt eller indtagelse LC50 48 h), blev pesticidstress først evalueret ved Toxicity Ratio (TR)-metoden, som er forholdet mellem den påførte mængde aktivt stof i μg cm−2 og toksiciteten på bier i μg bi−1 (kontakt eller indtagelse LC50 48 h). TR blev foretrukket frem for hovedkvarteret på grund af den højere konsistens af enheder (μg cm)−2 og μg bi−1) og den mere direkte fortolkning af forholdet. Faktisk er den sidste enhed af bi-cm−1 er omtrent det inverse af biens overflade (1 cm)2 Bi−1) således at en TR højere end 1 betyder, at den anvendte dosis kan have en dødelig effekt på mere end 50% af populationen, mens en TR lavere end 1 betyder, at den påførte dosis kan have en dødelig effekt på mindre end 50% af populationen. Toksicitetsforholdet (TR) blev anvendt på pesticiderne i området (Tabel S1 og Figur S6) og viste toksicitetsforhold på mere end 5 størrelsesordener fra 0,0019 for planteregulatoren NAA (1-nafthylacetinsyre) til 165 for insekticidet imidacloprid. Ved TR-metoden (Figur S3) er det tydeligt, at fra marts til oktober blev der næsten kontinuerligt anvendt meget giftige insekticider (TR > 100) i frugtplantagefarmen; de involverer imidacloprid (TR = 165), thiametoxan (TR = 144), begge neonicotinoide insekticider og pyrethroid-insektmidlet deltamethrin (TR = 133). Derudover blev flere andre giftige insekticider anvendt med en TR mellem 10 og 100, såsom chlorpyrifos-methyl (TR = 36) og emamectin benzoat (TR = 33) og med en TR mellem 1 og 10, såsom spinosad (TR = 8,4) og etofenprox (TR = 9,2). Udover insekticider blev der anvendt svampemidler næsten lige regelmæssigt fra marts til oktober på de forskellige afgrøder. Antallet af fungicidbehandlinger var endda højere end antallet af insekticider (Tabel 2). På trods af deres lave TR er deres sub-dødelige og kroniske effekter grundigt påvist i litteraturen (f.eks. [92,93]).
I frugtplantagefarmen blomstrede kulturer i marts og april, hvilket direkte tiltrak samlerbier i denne periode, men også senere kan bier tiltrækkes i sprøjteområdet på grund af tilstedeværelsen af naturlig vegetation blandt træerne (spontane urteagtige blomster) og omkring dem (akacie og Rubus sp.). Fødesamlerbier udsættes direkte for pesticider og passerer uden for bistadet i op til 12 timer om dagen; På den anden side kommer pupper og bistadearbejderbier i kontakt med pesticider, hovedsageligt via rester, der transporteres og opbevares ufrivilligt inde i bistadet. I maj og juni blev der registreret dødelighedstoppe i underkurvene i de kemiske og multistress-steder (Figur 6) samt det gennemsnitlige antal døde arbejdsbier pr. dag i de kemiske og multistress-steder (22,8 og 23,2 døde bi-dage−1, henholdsvis) var højere end i kontrolstedet (16,5 døde bier om dagen−1). Disse hændelser kan direkte relateres til eksponeringen for pesticider, som var fælles for de to eksponeringssteder. Desuden udgjorde dødeligheden i underkurvene kun en del af bidødeligheden og kan i højere grad relateres til pesticidrester, der blev transporteret ind i bistadet. I litteraturen vurderes eksponering for pesticider ofte gennem analyse af pesticidrester i pollen og honning [94,95] eller ved mere komplekse semi-kvantitative indeks [96,97]. Forfatterne til [22] rapporterede en liste over 34 pesticider fundet i voks, bier, honning og bibrød, som stammer fra italienske kolonier. Blandt dem, der blev anvendt i det eksperimentelle område af den nuværende forskning (Tabel 2), blev insekticiderne imidacloprid, thiamethoxam og tau-fluvalinat fundet af [22] i bibrød i koncentrationer på 14−99 ng g−1, 14−1619 ng g−1 og 16−1537 ng g−1, henholdsvis, og fungiciderne pyrimethanil, cyprodinil, fludioxonil og tebuconazol i koncentrationerne 18−584 ng g−1, 22−1560 ng g−1, 7−271 ng g−1 og 263 ng g−1, hvilket viser, at forskellige aktive ingredienser i både insekticider og fungicider kan findes i bistadet som rester i fødevareopbevaring. Desuden er pesticider kendt for at kunne bestå i honning, voks og pollen i lang tid [98], hvilket forlænger eksponeringsperioden ud over behandlingerne. Det gør det umuligt i marken at have den direkte sammenhæng mellem eksponering (pesticidanvendelse) og toksicitet, hvilket bestemmer en tidsforskydning og de kumulative effekter af pesticidets stress.
Det er vanskeligt at forklare modulationen af biomarkørniveauer i forhold til eksponering for de overvejede stressfaktorer, da mange og ofte uforudsigelige faktorer er de involverede faktorer. Desmet et al. [99] dokumenterede uoverensstemmelser i immunsuppressions- og afgiftningsmekanismer mellem honningbier, der blev udsat for imidacloprid i laboratoriebure, og honningbier i marken. Markbier viste en mere robust respons med immunstimulation. Af denne grund kan vi kun diskutere resultaterne på en spekulativ måde og sammenligne dem med anden forskning udført i laboratoriet eller i felten. Vi kan betragte den opnåede modulation og de effekter, der er kendt i litteraturen for bier og andre organismer, for at retfærdiggøre vores resultater og sammenligne stressorerne. Hæmningen af AChE-aktivitet i det stærkt stressede område stemmer overens med resultaterne fra [71], hvor bier indsamlet fra landbrugsområder skubbede en reduktion af AChe-aktiviteten frem. Det er dog mærkeligt, at den samme hæmning ikke blev dokumenteret i det kemiske stresssted. Desuden er den største aktivering af gennemsnitlig CAT-aktivitet i pupper i det kemiske stressområde sammenlignet med kontrol i overensstemmelse med resultaterne i [100], hvor aktivering af CAT blev observeret i larver af Chironomus riparius udsat for høje koncentrationer af et pesticid. Tværtimod kan den lavere aktivering af CAT i multi-stressstedet sammenlignet med det kemiske sted skyldes tilstedeværelsen af elektromagnetisme, som det fremgår af [101], hvor en reduktion af CAT hos mus udsat for stråling blev dokumenteret. Desuden, da GST’er er en stor familie af multifunktionelle enzymer, der er involveret i afgiftning af en bred vifte af xenobiotika, herunder insekticider, er den betydelige aktivering af GST i både pupper og arbejderbier i det kemiske stresssted sammenlignet med kontrolstedet i overensstemmelse med, hvad der blev forventet. Anderledes er situationen for multi-stress stedet, hvor GST ikke var væsentligt forskellig fra kontrolstedet; dog er dette enzym ekstremt variabelt, og forskellig forskning har påvist dets reduktion hos dyr, der blev udsat for stråling [102,103]; Derfor kan det være muligt, at dette resultat var en balance mellem pesticidernes og elektromagnetismens effekt på bier. Det er kendt fra litteraturen, at eksponering for pesticider forårsager en stigning i oxidativt stress i adskillige organismer [104,105,106], herunder bier [41,69,107,108], hvilket også indebærer genetisk skade [105]. I det nuværende studie blev ROS-niveauerne i pupperne fundet højere i det kemiske stressområde end i kontrolgruppen, med den mest tydelige ROS-stigning fra juni til september, hvor de fleste pesticider blev påført. Overraskende nok var ROS-niveauerne i multistress-området ofte lavere end i pesticid-stress-området, og marginale gennemsnitsniveauer hos arbejderbier var endda lavere end i kontrolstedet, hvilket viste en kontrasterende effekt af pesticidet og elektromagnetisk eksponering. Litteraturstudier, der rapporterer en stigning i oxidativt stress forårsaget af eksponering for pesticider, blev hovedsageligt udført med samlerbier, der har en mere direkte og akut eksponering for pesticider. Det er muligt, at den lavere eksponering af pupper og bistadearbejderbier for pesticider kunne have reduceret evidensen for en sådan effekt i det nuværende arbejde. Dog viste nogle prøvetagningsdatoer en tydelig stigning i lipiden peroxidation hos arbejderbier i kemiske og multistress-steder, såsom den 15. juni og den 14. september. DNA-fragmentering gav modstridende resultater; faktisk er der, udover prøvetagningsdatoer, hvor eksponeringsstederne var lavere end i kontrolområdet (såsom 3. juli for arbejderbier), også andre datoer, hvor eksponeringssteder viste større DNA-fragmentering end kontrolstedet (såsom 27. juli for arbejderbier). Disse kontrasterende resultater er vanskelige at forklare uden at tage højde for, at der også i kontrolstedet kan være diffuse stresskilder, der kan ændre de fysiologiske niveauer af de betragtede biomarkører.
I multi-stressstedet ønskede vi at evaluere de kumulative effekter af to forskellige stressfaktorer: eksponeringen for pesticider (de samme som på det kemiske sted) og tilstedeværelsen af et elektromagnetisk felt genereret af en elektrisk transportledning placeret over de eksperimentelle bistader. Elektromagnetiske felter er kendt for at forårsage forskellige biologiske effekter såsom oxidativt stress, genotoksiske effekter og dysfunktioner i immunsystemet, alle observeret på forskellige dyrearter [109]. De negative effekter af elektromagnetisk stråling udsendt af antenner, mobiltelefoner og højspændingsledninger er blevet undersøgt hos mennesker [110,111,112,113] og hos dyr, herunder mus [114], flagermus [115], fugle [116,117] og insekter [118]. På bier blev både elektromagnetiske felter genereret af mobiltelefoner [109,119,120] og dem genereret af højspændings-el-transportlinjer [121] undersøgt. I dette studie viste den kumulative effekt af kemisk og elektromagnetisk felteksponering (multistress-tilstande) den værste generelle helbredstilstand, taget hensyn til koloniens overlevelse, patologisk fremkomst og adfærdsmæssige anomalier som unormal honninglagring og overskud af drone-yngleaflejring. For antallet af dronningeændringer og dronningedødeligheden i underkurven forekom dobbelt så høj rate i kontrol og endda i kemisk stress-sted. Især adfærdsanomalier, der er blevet vist i litteraturstudier, afslørede, hvordan biers eksponering for ELF-frekvenser fører til en stigning i motorisk aktivitet med forbigående stigning i bistadetemperatur, vægttab i bistadet, tab af dronninger med unormal produktion af kongelige celler, reduceret yngel med hætte og dårlig vinteroverlevelse [42]. Ud over elektromagnetisk feltstress er den kroniske eksponering for visse pesticider i sub-dødelige koncentrationer kendt for at reducere evnen til overvintring og kompromittere evnen til at fodre og opfostre selvforsynende dronninger og droner [98]. I det foreliggende studie bidrog kombinationen af begge faktorer i multi-stressstedet til de skadelige effekter, der observeres på dette sted, hvilket bekræfter de kroniske effekter af kemisk og elektromagnetisk felteksponering.
Ved at analysere biomarkørværdierne i multistressstedet kan man observere, at de generelt følger dem i det kemiske sted uden en klar multistress-effekt. Der er dog flere specifikke effekter, der kun observeres i multi-stress-stedet, især ved sæsonens afslutning (sidste prøvetagning den 14. oktober). Den første er den markant lavere stigning, både i pupper og arbejderbier, i AChE-aktiviteten i forhold til kontrollen og det kemiske stresssted. I litteraturen viser nogle studier udført på pattedyr, at ELF i intervallet mellem 50 og 90 Hz mindsker aktiviteten af dette enzym [122]. Et andet interessant resultat, observeret ved den sidste prøvetagning (14. oktober), vedrører ALP-overaktivering både hos arbejderbier og pupper med hensyn til kontrol- og kemisk stresssted (Figur 8). Dette resultat stemmer overens med en tidligere opdagelse af [11] og antyder, at den enzymatiske overaktivering ved sæsonens afslutning kan relateres til tilstedeværelsen af et elektromagnetisk felt ved lave frekvenser, ifølge flere studier udført på forskellige modelorganismer [43,123], herunder bier [42]. Den observerede enzymatiske overaktivering ved sæsonens afslutning understøtter hypotesen om en adfærdsmæssig overaktivering hos individerne, som tværtimod burde reducere deres aktivitet for at kunne bevare sig selv for at overleve hele vinteren. Den neurologiske enzymaktivitet (AChE) og en samtidig metabolisk overaktivering (ALP) kan kompromittere prøvernes og koloniens overlevelse under overvintringen.
5. Konklusioner
Dette studie dokumenterede, at både stress (kemisk og elektromagnetisk) forårsagede negative effekter på eksponerede kolonier på grund af sygdomsforekomst (amerikansk foulbrood), dødelighed i underkurvene og adfærdsændringer (dronningeændringer, overskydende drone-aflejring og honninglagring). I detaljer syntes dødeligheden i underkurvene at være mere relateret til det kemiske stresssted, mens de fleste adfærdsændringer kun var i multistress-området. Overordnet bekræftede tabet af tre ud af fire familier i multistress-stedet multistress-tilstandens rolle som mekanismen, der forårsager fænomenet bikube-depopulation (CCD).
Selv hvis dette studie ikke tillod test af den synergiske vs. additive effekt af multistress-tilstandene, da enkelt stress kun blev testet for pesticid-stress, foreslår vi, at der i det mindste kan defineres additive effekter for vores multistress-tilstande, da flere studier af ELF-EF-effekter har rapporteret sub-letale effekter på bikolonier.
Stigningen og faldet i enzymatiske biomarkører påvist på eksponeringssteder sammenlignet med kontrol viste et komplekst billede af det eksperimentelle forsøg. Da biomarkøranalyser dog ikke gav evidens for additive eller synergiske effekter, opstår hypotesen om, at den kontrasterende effekt af forskellige pesticider og de to stresskilder kan have reduceret deres diagnostiske styrke. Pesticidstress viste klare effekter på flere velkendte biomarkører såsom AChE og CAT, og indirekte beviser for ROS-stigning og -skader (LPO) på pesticidstressstedet blev observeret (diagnostisk værktøjs rolle). Den observerede mindre udtalte stigning i AChE-aktiviteten ved sæsonens afslutning i begge livsstadier bekræftede tidligere resultater af ELF-EF-effekter og kan betragtes som et yderligere element, der kan true vinteroverlevelsen. Desuden bekræftede den observerede ALP-stigning ved sæsonens afslutning i begge livsstadier hypotesen om en adfærdsmæssig overaktivering af biaktivitet i denne periode, hvor bierne bør reducere deres stofskifte for at forberede sig på overvintring; Denne effekt indikerer en ændret fysiologisk tilstand, som ifølge litteraturen kan reducere overvintringssuccesen; dette studie synes at antyde, at ALP-stigningen i både pupper og voksne bier ved sæsonens afslutning kan betragtes som et prognostisk signal om reduceret vinteroverlevelse.
Alle de resultater, der er opnået i den nuværende forskning, bekræftede biomarkøranalyser som et nyttigt diagnostisk og prognostisk værktøj.
Supplerende materialer
Følgende er tilgængelige online på https://www.mdpi.com/article/10.3390/insects12080716/s1, Figur S1: Eksperimentelle bistader på de tre forsøgssteder: kontrolsted (A), pesticid-stresssted (B), multi-stresssted (C), Figur S2: Billedudarbejdelse af en kam ved siden af Image J-softwaren. (A) Forberedelse til arealberegning; (B) eksempel på definition af arbejdernes yngleområde, Figur S4: Klæbende klæbeplade placeret under gitteret i skuffen nederst i bistaderne til indsamling af naturligt faldne varoamider, Figur S5: Behandlingsplan for de aktive ingredienser brugt i 2017 (kg a.i. ha−1) i frugtplantageanlægget, hvor eksponeringsstedet var placeret, Figur S6: Toksicitetsforhold (bi-cm−2) af de aktive ingredienser, der blev brugt i 2017 i frugthaven, hvor eksponeringsstedet var placeret. Figur S7. Meteorologiske data er hentet fra meteorologiske stationer “Rivolta d’Adda” og “Cavenago d’Adda” under det regionale miljøbeskyttelsesnetværk. De to meteorologiske stationer ligger henholdsvis 3 km øst fra kontrolstedet og 14 km sydøst fra eksponeringsstedet. Tabel S1: Pesticiddosis (kg a.i. ha−1 og i μg a.i. cm−1), oral og kontaktakut toksicitet (μg a.i. bi−1) og toksicitetsforhold (bi-cm−1) af de aktive ingredienser, der blev brugt i 2017 i frugthaven, hvor eksponeringsstedet var placeret.
Læs mere her:
